单克隆抗体制备公司生产工艺

日期：2024-12-10 11:13:31

单克隆抗体制备生产工艺主要包括以下步骤：

一、抗原提纯与动物免疫

抗原准备：对抗原的纯度要求较高，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫.

动物选择与免疫：一般选择与所用骨髓瘤细胞同源的 BALB/c 健康小鼠，鼠龄在 8-12 周，雌雄不限。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般 2-3 周.

单克隆抗体制备公司

二、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

骨髓瘤细胞株选择：如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是 Sp2/0 细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，且本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链.

细胞状态调整：细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞，活性应大于 95％。融合前骨髓瘤细胞株需先用含 8 - 氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为.

饲养细胞制备：常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞。饲养细胞调至，提前一天或当天置板孔中培养.

三、细胞融合

细胞混合：将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，常用比例为 1:4.

加入促融合剂：加入促融合剂聚乙二醇，在其作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞.

稀释与培养：将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养，培养液的成分对融合细胞至关重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制.

四、选择性培养与阳性克隆筛选

选择性培养：采用 HAT 选择性培养基进行培养，只有融合的杂交瘤细胞才能在该培养基中持续存活一周以上，而未融合的游离 B 细胞只能存活 3 天而后自行死亡.

阳性克隆筛选：对每个含有杂交瘤细胞集落的生长孔中的上清液进行抗体检测，检测方法有放射免疫测定、酶联免疫技术测定等，筛选出能够稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交细胞.

五、杂交瘤细胞的克隆化培养

通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，一般稀释至 0.8 个细胞 / 孔，按 Poisson 法计算，应有 36％的孔为 1 个细胞 / 孔。细胞培养至覆盖 0％-20％孔底时，吸取培养上清用 ELISA 检测抗体含量，筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化.

六、单克隆抗体的大量制备

体外培养法：将筛选出的阳性细胞株在体外培养，一般应用无血清培养基，需用特殊的仪器设备，如悬浮培养采用发酵式的生物反应器等，培养液中可分离得到单克隆抗体。其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式.

动物体内诱生法：选用 BALB/c 小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，通常在接种一周后即有明显的腹水产生，腹水中富含大量的目的抗体，每只小鼠可收集 5-10ml 的腹水，有时甚至超过 40ml，但腹水中也含有大量宿主蛋白和少部分宿主抗体，纯化难度相对较大.

七、单克隆抗体的纯化

单克隆抗体的纯化方法有多种，一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法，目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，如用葡萄球菌 A 蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达 90％以上.