超越干细胞，癌症研究新风向，为何它能开启精准医学新时代？
日期：2020-12-18 14:06:05
在和癌症斗争的历史里，人类做过无数次的尝试，从小分子研究，到大分子核酸、多样性蛋白，再到细胞治疗，从未停歇脚步。而干细胞的出现极大地推动了再生医学的发展，涵盖了基于细胞的高通量药物筛选、细胞移植和器官移植等应用领域，展现了广阔的应用前景。
而医学界近几年最热门的研究——外泌体，作为介于分子和细胞之间的微小结构，原以为是干细胞所代谢出的废弃物，经多年研究却发现它在治疗疾病、修复身体机能上占有不可缺席的地位！源自于干细胞的外泌体也成为了关注的热点，为疾病的诊断和治疗带来了新思路。
外泌体用途比干细胞更广，关键在于：不会被身体排斥。
Oncogene十月刊发了膀胱癌中MSC衍生的外泌体miR-139-5p功能的研究。
microRNA可以通过间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体传递至肿瘤细胞，发挥其功能。RNA定量检测发现复合物PRC1（polycomb repressor complex 1）在膀胱癌中表达上调，体外实验证实PRC1沉默阻碍肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。双荧光素酶报告基因实验证实PRC1受miR-139-5p的调控。接下来，将膀胱癌细胞与从过表达miR-139-5p的人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）中分离出来的外泌体共培养，来自hUCMSCs的外泌体的miR-139-5p可以转移到膀胱癌细胞中，下调PRC1的表达。此外，体内体外实验均证实hUCMSCs衍生的外泌体miR-139-5p具有抑制膀胱癌发展的作用。这一结果突显了利用MSC衍生的外泌体miR-139-5p治疗膀胱癌是一种有前景的治疗策略。
2013年，外泌体因诺贝尔医学奖而被众人知晓，也因此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。外泌体在体液中广泛存在及易获得性等特点被誉为液体活检"新秀"，成为疾病的精确诊断和治疗研究的热点。
外泌体是什么
外泌体（Exosomes）是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150 nm 的具有脂质双层膜的微小膜泡，它广泛存在并分布于血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液和乳液等多种体液中。
外泌体携带和传递重要的信号分子，包含细胞溶质蛋白、 参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白质，参与细胞活动的重要调控，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。
外泌体的表面marker主要有CD9、CD63、CD81、PKM、ENO1、TSG101、热休克蛋白家族等。其中脂质双分子层中含有丰富的Phosphatidylserine。
▲图片来源：Exosomes:Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology
外泌体投资热潮涌现
作为液体活检领域的"三大标杆"之一，外泌体被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体，外泌体通过其携带的脂质、核酸、蛋白质、miRNA等来调节受体细胞的生物学活性，从而参与机体免疫应答、细胞迁移、肿瘤侵袭、抗原提呈等生物学过程。大量的证据表明外泌体及其内容物具有成为新型诊断标志物的潜能，在临床和治疗方面展现出了极具前景的研究价值。
在学术研究方面，国家自然基金项目查询所示：近10年，外泌体相关项目数量从500上升到了接近2000个（数量上增加了近4倍）；资助金额增长了近6倍。2019年的外泌体相关的国家自然科学基金中标总计已达2.13亿元，较2018年1.69亿元增长26%，2018较2017年1.23亿元增长37%。
外泌体受到越来越多的关注，涌现了大批的外泌体相关研究课题，以迅雷不及掩耳之势火了起来。
而在资本的助力下，外泌体在治疗和诊断方向的应用也从实验室的研究阶段迅速推进，迎来了产业化合作新浪潮，成为下一个群雄角逐的黄金赛场。外泌体产业在欧美日已蓬勃发展，迄今为止，全球约有40多家外泌体治疗和诊断的公司。
▲外泌体公司列表
Codiak BioSciences作为投资者的宠儿，2019年1月，生物制药公司Jazz Pharmaceuticals和Codiak BioSciences宣布价值10亿美元的战略合作，共同研究、开发和商业化工程外泌体，为难以治疗的癌症创建外泌体疗法。
2020年6月份，礼来、武田、拜耳宣布了与外泌体公司高达20亿美元的交易。其中，礼来与英国Evox Therapeutics 签署了一项价值 12 亿美元的合作协议，未来双方将利用Evox专有的外泌体药物递送平台，开发RNA干扰和反义寡核苷酸药物有效递送载体，用于神经系统疾病的治疗。
外泌体最新研究进展
外泌体从发现至今已有30多年的历史，虽然最初被认为可能是细胞的“垃圾”，所以才被排出来，但是近年来研究表明外泌体具有功能活性并可进行细胞间信息传递。作为信号分子的载体，外泌体在生物体内介导多个核心生物过程，包括免疫监视、炎症抑制反应、干细胞未分化状态的维持与可塑性、邻近和远端细胞的增殖与凋亡抑制等。
白癜风是由自体表皮黑色素细胞的逐步破坏引起的皮肤脱色疾病。适应性免疫中CD8+、Treg和Th17细胞失衡为特征的自身免疫性不耐受被认为是造成白癜风中黑色素细胞破坏的主要原因。Autoimmun Rev 9月刊的一篇文章调查了外泌体与白癜风的关联，强调了外泌体的免疫调节作用。在病理和生理条件下，外泌体途径对于调节CD8+，Treg和Th17细胞都是必需的。在病理条件下，分泌的外泌体可影响疾病微环境中CD8+，Treg和Th17细胞的平衡，环境失衡可能破坏自身免疫耐受，导致白癜风。另外，外泌体在黑色素生成途径中，充当角质形成细胞和黑色素细胞之间通信的介质，可能也参与黑素小体的运输。
越来越多的研究表明脂肪组织、炎症反应、非酒精性脂肪性肝（NAFLD）和酒精性脂肪性肝（AFLD）与肝细胞肝癌（HCC）的发生密切相关。最近，美国北卡罗莱那中央大学的研究者们提出脂肪细胞分泌的外泌体（AdExos）和HCC分泌的外泌体（HCCExos）营造了一个持续的慢性炎症环境，导致HCC进展。AdExos和HCCExos均含有细胞特异性的细胞内分子，包括各种mRNAs、microRNAs、lncRNAs、circRNAs、脂质、代谢物以及蛋白。作为自分泌或旁分泌的信号分子，这些内含物能激活与细胞增殖、血管生成、细胞浸润、肿瘤恶化相关的信号通路，形成肿瘤微环境中脂肪细胞和HCC的动态互联，造成HCC进展。
免疫检查点抑制剂（ICI）的诞生是抗肿瘤药物领域的重大创新，然而最近有报道表明ICI的抗肿瘤治疗会引起不良心血管事件。不良心血管事件包括心肌炎与心肌病、心肌纤维化、心力衰竭和心包病变等。心脏的衰老过程伴随着各种心脏疾病的发生。外泌体通过传送各种生物分子（包括microRNA）来调控心脏疾病中细胞间的通讯联系。miR-34a-5p是一个与心脏衰老相关的microRNA。温州医科大学的研究者们利用小鼠疾病模型研究了外泌体miR-34a-5p与PD-1抑制剂引起的心血管不适之间的关联。他们发现，PD-1抑制剂处理过的巨噬细胞衍生的外泌体通过调控miR-34a-5p/PNUTS信号通路发挥促心肌衰老的作用。这一结果在线发表在J Immunother Cancer十月刊。
外泌体市场/临床应用
肿瘤患者血清中分离的外泌体，其内含物miRNAs的表达谱与肿瘤进展紧密关联。外泌体miRNAs被发现在反复冻融的环境里、在-208 °C的超低温下存储5年仍然保持稳定。外泌体miRNAs的高稳定性使其成为监测疾病进展的有价值的生物标志物。目前已在多个肿瘤类型中，包括非小细胞肺癌、鼻咽癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等，鉴定出可用于监测肿瘤进展的外泌体来源的分子标记。
2016年，依赖外泌体谱的肿瘤诊断产品在美国上市。ExoDx Prostate（IntelliScore）和ExoDx Lung（ALK）是基于液体活检方法的两种商品化检测试剂盒，可分别用于检测血清和尿液中前列腺癌或肺癌标志物。对于肺癌和前列腺癌，常规的诊断方法是侵入性诊断法。而ExoDx Prostate（IntelliScore）使用非直肠指诊尿样，分析样本中高分型前列腺癌患者携带的三种标志物，然后使用专有算法分析结果并预测患病风险。同样，ExoDx Lung（ALK）利用定量PCR方法分析血清中的外泌体RNA，可检测非小细胞肺癌中五种不同的EML4-ALK融合基因转录本，此方法可用于有患肺癌风险人群的预后检测。
由于外泌体具有与当前用作药物递送系统的纳米颗粒相似的特性，比如稳定性、通透性、免疫原性较低、毒性较低、生物相容性高等，外泌体也可被用作临床治疗的给药工具。临床药物研究中，除传统的化疗药物外，天然产物和干扰小RNA已成功封装在外泌体中，用于靶向治疗乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和成胶质细胞瘤。
外泌体分离提取
外泌体的分离方法有很多种，常用的有超速离心法、密度梯度超速离心法、多聚物沉淀法（PEG）、免疫磁珠法、试剂盒分离法等。
商品化试剂盒多采用聚乙二醇沉淀法、超滤法和免疫学方法分离外泌体。
超速离心法和密度梯度离心法是最常用的外泌体纯化手段。这两种手段因获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，而且对仪器设备要求高（需要超速离心机）且回收率不稳定，纯度也达不到要求。
多聚物沉淀法操作简便，不需要额外的设备，然而PEG沉淀会夹杂分离大量杂质(蛋白、脂类等)，颗粒大小不均一，存在于分离物中的聚合物也可能会干扰下游分析。
免疫磁珠法利用包被单克隆抗体的磁珠结合外泌体，可保证外泌体形态的完整，特异性高，但免疫沉淀需要特异性抗体，检测成本高，且仅能捕获表达特定抗原的目标外泌体，效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，囊泡完整性是个调整，不利于下游实验。
综上所述，现有技术的方法提取到的外泌体，缺陷在于：收率较低，耗时长、纯度不高，外泌体囊泡不完整等。
鉴于上述问题，九州网页版登录入口工程有限公司研发的外泌体提取试剂盒提供了一种简单可靠的方法可从细胞培养上清液，血清，血浆，乳液，尿液，唾液，酵母中提取完整的外泌体。该产品提取的外泌体囊泡适用于下游的电镜分析、NTA分析、纳米流式（NanoFCM）分析、Western Blot、荧光定量（qPCR）和高通量测序等应用。
该试剂盒通过蛋白亲和的方式分离外泌体，无需超速离心即可实现高效率地从各种类型样本中提取高纯度、囊泡结构完整的外泌体，具有简便、稳定、易操作的优点。
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2018年3月31日，华美生物兄弟公司生之源与2013年诺贝尔生理学或医学奖得主兰迪·谢克曼教授举行签约仪式，并建立诺贝尔奖工作站。此举大大助推了华美外泌体相关科研产品的研究和生产！
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外泌体未来展望
外泌体爆炸性研究活动已经慢慢演变为分子医学的快速发展。外泌体在临床医学中有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态、诊断疾病、治疗反应、疾病进展等。重要且有影响力外泌体研究领域会随着高效率的外泌体分离技术的发展而发展。
外泌体可作为生物标志物用于疾病的诊断，也推动了以外泌体为靶标的治疗方法研究或将外泌体本身用作治疗工具的研究。将外泌体用作治疗工具的临床研究正在开展之中，其目的是研究患者自身MSC分泌外泌体或健康捐赠者体内外泌体用于治疗的安全性和有效性。这个趋势下，外泌体用作药物输送系统作为基因治疗的潜在载体有可能变得更加普遍。外泌体在癌症中同时发挥免疫激活和免疫抑制功能，外泌体肿瘤免疫疗法有望诞生抗癌疫苗。更全面的了解外泌体功能，促进“有益”外泌体的分泌，抑制“有害”外泌体的分泌，从而实现疾病的预防与治疗。随着完整外泌体和它们的功能的逐渐解密，预计在不久的将来，更多令人兴奋的外泌体应用将会出现。
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