构建基因敲除的细胞系有哪些方法和步骤?
日期：2024-07-16 13:53:17
基因敲除常用于研究基因在细胞功能中的作用。下面是常用的基因敲除细胞系构建方法和步骤：
插入突变（Knock-in）：通过转基因技术将外源DNA片段插入至目标基因位点，使目标基因发生突变而实现基因敲除的目的。这个过程通常需要克隆目标基因的编码序列，并将突变（例如终止密码子）或荧光标记等片段插入其中。
CRISPR/Cas9敲除：利用CRISPR/Cas9系统，设计合成质粒（sgRNA和Cas9蛋白），导入靶向基因组并诱导DNA双链断裂。通过细胞自我修复机制（非同源末端连接或同源重组），实现对靶向基因的敲除。
RNA干扰（RNAi）：通过转染siRNA或shRNA质粒，引入RNAi技术实现对特定基因的敲除。
背景细胞的选择：基因敲除细胞系的构建需要使用背景细胞，如CHO、HEK293等，根据需要选择合适的背景细胞株。
细胞的筛选鉴定：针对基因敲除细胞系的构建，需要通过PCR、Western blot或免疫组化等方法，对细胞系进行筛选鉴定，确保目标基因的敲除效果。
单克隆的建立：通过稀释法或限稀释法等方法，建立单克隆基因敲除细胞系，以保证其遗传纯度和稳定性。
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