检测小RNA的新方法

双光子显微镜在实验生物学中正变得越来越有必要。其应用范围包括追踪细胞和亚细胞的运动，监控稀有事件，并记录小型结构的高速信号。神经元树突和树突棘很小，而神经电生理信号又很快，如膜电位或离子浓度的瞬变，这使得这些结构的功能研究必须使用高时空分辨率的记录方法。

在这方面，传统的双光子显微镜，再加上对生理参数敏感的荧光指示剂，只提供了部分解决方案，带来了近衍射极限的空间分辨率。这是因为，传统的双光子显微镜使用相对较慢的束扫描方法，它严重限制了功能数据可被记录的程度。

在这篇protocol中，作者详细介绍了高速双光子成像系统的发展，并讨论了在选择附加部件时必须考虑的重要因素。作者提到，大部分高速双光子成像系统在光学设计上类似于传统的系统，包含四个主要的部件：光源、扫描仪、显微镜和检测器。不过，这些部件的选择主要取决于所使用的扫描技术。

在任何细胞中，RNA种类的数目都是非常复杂的。RNA的大小从20 nt到几kb不等，且丰度也差异很大，每个细胞中可能只有几个拷贝，也可能有几十万个拷贝。如今大家对于RNA的兴趣日益浓厚，希望了解特定RNA物种的丰度和完整性。

这篇protocol介绍了一种检测小RNA的新方法：夹板连接法（splinted ligation）。它的原理是：在互补的“DNA夹板”或“桥梁”寡核苷酸存在时，依靠T4 DNA连接酶将RNA分子的末端3’-羟基与DNA链经过标记的5’-磷酸基团相连，之后可通过变性凝胶电泳和磷屏扫描来观察。这种方法建议用于特定小RNA（如miRNA和piRNA）的常规检测和定量。

作者认为，这种方法在检测小RNA上比northern blotting要灵敏得多，且操作更快。同时，它也是定量的，可用于比较不同样品中小RNA表达的水平。