单分子测序助力髓母细胞瘤外显子组测序研究

PacBio第三代测序技术在De novo测序、Target测序以及DNA Modification等领域的应用越来越广泛，发挥的作用也越来越不可替代。而Broad研究院的科学家们更证明， PacBio RS不仅可以作为基因组研究手段，而且也是极好的基因分型、变异验证与重复实验的平台（第三代测序：单分子测序在基因分型与突变验证中的应用）。

最近Nature杂志发表了一项关于髓母细胞瘤外显子组测序的研究，在该研究中，麻省理工和哈佛大学医学院的科学家们利用PacBio平台成功对Illumina Hiseq2000外显子测序数据中的变异位点进行了验证分析。

科学家们首先用外显子捕获平台结合illumina Hiseq2000完成了对92例髓母细胞瘤患者病灶/正常对的测序，分析出多个可能的点突变位点，然后利用PacBio平台对48个外显子的PCR扩增产物进行验证分析，最终确认了12个与髓母细胞瘤相关的变异，其中在RNA解旋酶基因DDX3X上的突变是以前从未发现的，为这种疾病的基础研究和诊断提供了新的Marker。此外，科学家们对PacBio验证数据与Hiseq2000数据的比对分析也证实，虽然PacBio单分测序容易产生较多的indel错误，但是其中大部分都是随机性的，可以通过软件进行修正。

“尽管PacBio SMRT测序方法有着比较高的indel错误率，但是利用这个技术可以非常容易的对CTDNEP1基因中的2bp deletion突变与其他随机indel突变进行区分和识别”Illumina Solexa平台产生的测序数据多是150bp左右的短片段，需要利用复杂的生物信息学分析手段对数据进行过滤、定位、组装等分析。而且测序片段过短容易产生定位错误等问题，依赖PCR的测序方式也会不可避免的引入系统性测序误差从而产生较多的假阳性。因此，一般需要利用另一种准确度更高的方法对其产生的变异数据进行交叉验证。Sequenom质谱法和Sanger测序方法无疑是验证的金标准，不过质谱法无法探寻未知位点，Sanger测序通量低又容易引入人为误差。PacBio RS测序技术具有单分子的分辨率，不引入PCR过程，其CCS测序模式所产生的数据准确度非常高，可以对基因组中的低频变异进行高效的释读，而且单分子测序的读长长，可以寻找除已知位点以外的其他漏检稀有突变，有效弥补Sequenom和Sanger方法的缺陷。