最新综述：超越5种碱基的DNA测序（二）

研究显示自动化末端染色的Sanger测序方法能检测常见的三种细菌表观遗传学标记4-mC, 5-mC和6-mA。DNA模板中的甲基会影响双脱氧终止法的核苷酸编入，与无修饰的对照DNA样品数据比较时，会引起荧光示踪色谱图的峰值变化。当模板含6-mA时T信号较高，含5-mC时G信号较低，而含4-mC时G信号较高，以此可以区分不同的胞嘧啶修饰形式。该方法已用于检测幽门螺杆菌、E. coli和脑膜炎奈瑟氏菌中的甲基转移酶。不过就我们所知，这一方法并没有广泛应用于细菌基因组甲基化检测。可能是由于该方法得到的信号量级较小，且Sanger测序本身通量相对较低。我们也没有发现应用这种方法检测其他DNA碱基修饰的尝试。

第二代DNA测序技术依赖样品制备阶段的DNA扩增，这会造成碱基修饰的损失，并且阻碍了测序手段在检测碱基修饰上的应用。因此，碱基修饰位点研究主要集中在应用各种样品前处理技术，间接推测碱基修饰的存在。通过重亚硫酸盐测序，第二代测序被广泛用于检测5-mC的丰度和动态调控。此外有文献描述了一种应用MspJI家族限制性内切酶的方法。这种酶识别DNA中的5-mC或5- hmC，并在碱基修饰的上游12个碱基和下游16个碱基处切割一个短DNA片段。提取这些片段进行第二代测序，就能确定基因组中碱基修饰的位点。这种酶对于胞嘧啶修饰侧面的不同碱基有偏好，因此在建立全基因组修饰图谱时会造成偏颇。重亚硫酸盐和MspJI介导的测序目前都无法区分5-mC 和5-hmC。

科学家为了检测其他碱基修饰，采用了针对特定修饰的富集方法。Pull-down方法利用抗体或修饰特异性结合蛋白选择性富集含碱基修饰的DNA片段，并进行高通量的DNA第二代测序，在测序片段上至少存在一个碱基修饰就能被检测到。然而，这种方法并不能得到确切修饰位点和哪条DNA链被修饰的信息。有文献描述了5-hmC DNA的不同富集方法，以及用于检测碱基J在基因组分布的anti-J抗体富集方法。

检测DNA修饰的新兴测序方法

将DNA测序灵敏度推至分析极限，并能得到单个DNA分子序列的新技术引起了科学家的广泛兴趣。开发这种新技术的动力之一，就是希望应用测序技术读取DNA碱基修饰信息。研究人员已采用了多种不同技术进行这方面的研究，有些技术已经商业化。

Helicos Biosciences的商业化技术采用在第二代测序基础上产生的gated sequencing-by-synthesis进行单分子测序。该技术结合DNA聚合酶和荧光标记技术，单独的DNA分子在一次一个碱基的延伸过程中能同时被检测到，检测步骤后末端基团被移除。该技术并不需要目标DNA的扩增，测序的成功依赖于在成像前DNA链上核苷酸的完全编入，所以可能难以找到一种方法能使该技术直接对DNA模板中的碱基修饰敏感。有文献报道科学家结合一种5-hmC特异性富集方法，应用该技术对胚胎干细胞中5-hmC DNA片段成功进行了全基因组作图。不过很可惜，Helicos Biosciences目前面临关闭，能否过关尚未可知。