携带多个目的基因的重组腺病毒的制备
日期：2010-06-25 11:10:10
目的基因的获取：
（1）特定细胞表达的目的基因：提取RNA后进行反转录，PCR扩增；
（2）载体中含有的目的基因：酶切或PCR获取；
（3）融合蛋白基因：根据需求，进行PCR合成目的基因；
2、穿梭质粒的构建：
（1）携带目的基因的穿梭质粒的构建：通过酶切、连接的方式得到，一般采用的是pShuttle-cmv载体；
（2）携带多个目的基因的穿梭质粒的构建：如同时表达两个目的基因，可通过IRES将两个目的基因相连；
（3）携带干涉序列shRNA的穿梭质粒：首先将H1启动子构建到pShuttle质粒上，然后将目的基因克隆到H1启动子下游；
3、重组腺病毒质粒构建：
携带目的基因的穿梭质粒线性化后与Adeasy-1共转BJ5183感受态细胞（电转），筛选得到重组腺病毒质粒，并经PacI酶切鉴定：可见目的质粒出现两条条带，分别为3.0kb或4.5kb和>23Kb两条条带。 将得到的重组腺病毒质粒转染DH5a感受态细胞，以便于保存。
4、重组腺病毒的制备：
将PacI酶切线性化的高纯度高浓度重组腺病毒质粒，以脂质体介导的方式转染293细胞，7～10天出现噬斑，待完全病变后，收集细胞和上清，于-70℃保存。
5、重组腺病毒的鉴定
在基因水平，提取腺病毒基因组DNA，采用目的基因的引物，PCR扩增病毒基因组DNA；并采用相应的引物，检测是否含有复制型腺病毒。
在蛋白水平，分泌蛋白，采用ELISA检测目的基因的表达；膜蛋白采用流式方法进行检测；其他蛋白采用Western-blot方法进行检测。
6、病毒扩增及纯化：
根据实验的需要扩增重组腺病毒（细胞实验20～40皿；动物实验60～80皿），并采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化，纯化得到的病毒用10％甘油保存。
7、病毒滴度测定：
紫外分光光度法检测病毒的OD260和280值：根据OD260nm可推算病毒的颗粒滴度； OD260nm/OD280nm代表病毒的纯度。
同时，采用快速CPE和TCID50测定病毒的感染滴度。 
