活体双光子成像

 一直以来科学家们都希望能了解我们人体在清醒状态下的大脑活动规律，但要实现这一点并不容易，近期来自北京大学生命科学学院的研究人员在在清醒猴认知行为条件下，最终实现了稳定时间超过6个月的双光子成像，这无疑为神经科学研究带来了新希望。

这一研究成果在线公布在2月16日的Neuron杂志上，文章的通讯作者是北京大学生命科学学院和麦戈文脑科学研究所唐世明研究员，第一作者为北京大学生命科学中心2014级博士生李明。唐世明早年毕业于北航，曾获第九届中国青年科技奖，入选新世纪“百千万人才工程”国家级人选等。研究组主要研究方向是采用电极阵列、光学成像、分子生化、双光子等研究技术，分析包括视觉皮层在内的复杂神经线路，研究视觉系统如何同时产生形状识别的选择性和不变性。

实时观测大脑中发生的活动，有助于科学家了解我们大脑运作的规律，找到治疗疾病的新方法。传统的成像方法需要停止组织的细胞活动，而双光子成像技术，能以单细胞至单突触分辨率，观察脑皮层大量神经元活动，近年来在神经科学领域获得广泛应用。

猕猴在认知行为、脑结构及功能方面都接近于人类，是人类脑疾病、视觉认知及其他高级认知功能研究理想的模式动物。由于大动物存在脑表面组织增生严重、脑组织跳动大、基因编码探针的表达效率低等困难，清醒猴长时期的双光子成像一直未能实现，成为该领域研究的一个技术瓶颈。

在这篇文章中，研究人员通过在猴视觉皮层显微注射腺相关病毒（AAV），转入基因编码探针，实现了清醒猴长时期双光子成像。新设计的成像窗口能有效防止颅内感染及硬脑膜增生，保持长达数月的稳定光学质量。AAV介导的基因编码探针，包括钙探针GCaMP5和GCaMP6s ，可以在猴视觉皮层获得长时期高效和稳定的表达。通过改进头部固定装置以及图像移动修正，获得了稳定的图像和高质量的神经活动信号，最终在清醒猴认知行为条件下，实现了稳定时间超过6个月的双光子成像。

这项还首次实现了在清醒猴双光子成像下，同时进行神经元胞内记录及单细胞电转等电生理研究及操作，证明了钙探针信号与神经元活动大范围的线性关系（10Hz - 150Hz），并能实现猴脑皮层神经元稀疏转染和树突成像。

双光子显微镜在实验生物学中正变得越来越有必要。其应用范围包括追踪细胞和亚细胞的运动，监控稀有事件，并记录小型结构的高速信号。神经元树突和树突棘很小，而神经电生理信号又很快，如膜电位或离子浓度的瞬变，这使得这些结构的功能研究必须使用高时空分辨率的记录方法。

在这方面，传统的双光子显微镜，再加上对生理参数敏感的荧光指示剂，只提供了部分解决方案，带来了近衍射极限的空间分辨率。这是因为传统的双光子显微镜使用相对较慢的束扫描方法，它严重限制了功能数据可被记录的程度。而现代高速双光子成像系统的发展越来越快，已经在多个研究领域中取得了进展。