华裔学者开发新型CLIP技术

 有数以百计的蛋白质可以与RNA结合，但是弄清有哪些蛋白在哪里结合RNA，以及它们相互作用之后发生了什么，一直都是一个挑战。

除了转录调控之外，还有更多的基因调控。随着研究人员越来越意识到RNA所扮演的不同角色，寻找这些核酸和RNA结合蛋白(RBPs)之间的相互作用，就显示出更大的重要性。数以百计的RBPs是已知的——其中很多涉及各种疾病，如神经退行性变、自身免疫缺陷和癌症，但是大部分仍有待于发现。发现RBPs结合的序列，可以阐明它们调控RNA转运、处理以及翻译的机制。

发现RBPs结合位置的最先进的方法，依赖于核糖核蛋白复合物的交联和免疫沉淀反应(CLIP)，然后进行测序。这些程序在技术上具有挑战性，需要放射性，实验的失败率很高，并会产生高百分比的重复读取。加州大学圣地亚哥分校的Eric Van Nostrand和Gene W Yeo在一封电子邮件中说道：“当执行大规模CLIP实验作为ENCODE联盟的一部分时，我们认为，当前方法没有足够的能力分析数以百计的因素。”他们及其同事创建了加强型的CLIP (eCLIP)，来解决这些问题。Gene W Yeo（姚伟明，音译）是加州大学圣地亚哥分校华裔学者，其负责的科学实验室主要研究RNA在调节人体正常及肿瘤干细胞生物学和神经分化方面的影响，包括计算生物基因组、建立RNA、干细胞生物学及疾病模型。

eCLIP从ChIP-seq借鉴了它的两步多路复用库制备技术。首先，研究人员将一个有索引的3’适配子（可允许随后的汇集），与附着于免疫沉淀反应珠子上的RNA片段连接起来。然后，他们通过电泳和消化掉蛋白质，分离了复合物。在反转录RNA后，他们在PCR扩增之前，将另一个包含内联随机5-或10-mer的3 适配子，连接到现在的单链DNA上。

逆转录往往会在交联部位终止，这可让研究人员获得核苷酸分辨率。在相同的顺序读取的情况中，随机单链DNA适配子序列，将能够区分来自PCR副本的独特片段，让后者被丢弃，从而使映射读取的数量更为定量，并减少了浪费的测序。此外，eCLIP为非特异性背景和固有偏误，添加了一个大小匹配的免疫沉淀反应前对照。

这些修改意味着，为了获得更高比例的可用读数并产生具有足够复杂性的文库，eCLIP需要的扩增比其他方法少大约1000倍，以识别更混杂的RBPs所使用的序列。现在，我们可以使用这些序列，来弄清RBPs如何完成它们的作用。