我科学家用CRISPR制备基因敲入猪

 目前为止，科学家一直未能制备出可产生种系嵌合体的猪多能干细胞。基于Oct4启动子的荧光报告系统，可被用于监控多能性，是制备真正的猪多能干细胞的重要工具。1月12日，来自中科院广州生物医药与健康研究院、吉林大学和云南农业大学的研究人员，在国际著名的综合性学术刊物《PLOS ONE》发表题为“Generation of Knock-In Pigs Carrying Oct4-tdTomato Reporter through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Engineering”的学术成果。在这项研究中，研究人员通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，制备了携带Oct4-tdTomato报告基因的基因敲入猪。

转基因猪在农业和生物医药方面都有着广泛的应用。然而，生殖系有活性的猪多能干细胞（PSCs）目前尚未制备出来，这阻碍了猪模型的遗传修饰。为了解决这个问题，一种可能的解决办法是，为猪PSCs生成一种荧光报告系统。

转录因子Oct4，又名POU5F1，可维持细胞的多能性，因此，它的表达反映了干细胞多能性。猪的Oct4报告系统之前已有过报道。然而，关于“猪Oct4启动子的基因组结构”的知识还是有限的；因此，小鼠Oct4启动子被用来控制EGFP的表达，猪Oct4基因起始密码子上游（4000 bp）也被用来作为Oct4启动子。

小鼠Oct4启动子与猪转录调节因子不能很好地相互作用，4000 bp组成型启动子可能并不包含所有的调控元件。在猪当中，我们可通过随机地将外源报告载体整合到猪基因组中，构建基于小鼠或猪Oct4启动子的荧光报告系统。组成型表达载体中Oct4启动子不完全的监控区域，以及这些载体的不确定的整合位点，可能会影响其调节功能的准确性。此外，拷贝数变化和内源性基因破坏的风险，可能会进一步影响报告基因的表达。将一个报告基因精确插入内源Oct4的框架，可允许内源性启动子诱导的报告基因表达，而不改变内源性Oct4的表达，从而可提高猪Oct4表达模拟的精度。

将外源基因敲入猪体细胞的基因组中，一直都是极为困难的，因为传统的同源重组（HR）效率极低。最近发展起来的CRISPR/Cas9系统，可在合成的单导向RNA（sgRNA）的辅助下，用简单的碱基互补，靶定和编辑特定的基因组位点。该CRISPR/Cas9系统已用于编辑各种生物的基因组，包括原核生物和真核生物。序列特异性核酸酶能有效地在DNA中产生双链断裂，并通过同源指导修复显著增加HR的效率。

在这项研究中，研究人员构建了一个猪Oct4的报告系统，其中内源性Oct4启动子可直接控制红色荧光蛋白（RFP）。通过同源重组（HR），研究人员将2A-tdTomato序列插入并替换猪Oct4基因的终止密码子。因此，荧光能准确地显示内源性Oct4的激活。利用CRISPR/Cas9系统，研究人员获得了在内源性Oct4基因启动子下游具有tdTomato基因敲入的猪胎儿成纤维细胞（PFF）系。转基因的PFFs可被用作体细胞核移植（SCNT）的供体细胞。

研究人员在SCNT胎儿的囊胚和生殖嵴中，检测到了强大的RFP表达。通过SCNT，研究人员也制备了两只有生活力的转基因猪。通过另一轮SCNT对来自胎儿和仔猪的成纤维细胞进行重编程，可导致重构囊胚中的tdTomato再激活。结果表明，监测细胞多能性状态的一个KI猪报告系统，已被成功构建。