中科院Cell Res发表CRISPR新成果

 来自中科院上海生命科学研究院、华西师范大学和北京大学等机构的研究人员报告称，他们利用CRISPR-Cas9系统在包含一种遗传病致病突变的精原干细胞 ( spermatogonial stem cell，SSCs )中成功地进行了基因编辑。这一重要成果发布在12月5日的《细胞研究》（Cell Research）杂志上。

中科院上海生命科学研究院的李劲松(Jinsong Li)研究员、吴立刚(Ligang Wu)以及北京大学的汤富酬（Fuchou Tang）研究员是这篇论文的共同通讯作者。

精原干细胞（SSCs）指位于曲精细管基膜上既能自我更新维持自身适量恒定，又能定向分化产生精子的一类原始精原细胞。来自不同物种的SSCs在加入胶质源性神经营养因子(GDNF)的培养基中可以维持很长一段时间。研究证实，将培育的SSCs移植到不育男性的睾丸中之后，其可以重建精子发生并恢复生育能力。

由于借助遗传操控SSCs及随后的移植，研究人员能够选取出想得到的遗传修饰，且有潜力以100%的效率生成健康后代，这些技术在构建基因修饰动物模型及治疗遗传疾病方面显示出广阔的前景。然而因为当前可用遗传编辑技术的复杂性和低效率，迄今为止利用这些技术来有效生成基因修饰动物的报道非常有限，也尚未有研究报道利用它们来纠正遗传疾病。

近年来，大量的研究证实来自细菌的CRISPR-Cas9系统能够以非常高的效率及特异性对不同的物种进行快速基因组编辑（延伸阅读：Nature子刊：新技术推动CRISPR、TALEN广泛介导基因敲入）。CRISPR-Cas9介导基因组编辑只需要一条很短的单导向RNA （single-guide RNA，sgRNA)引导位点特异性的DNA识别和切割，借助于非同源末端连接（NHEJ）介导的插入/删除或基于外源寡聚核苷酸的同源重组修复(homology-directed repair)，即可对靶位点进行基因修饰。相比于其他的遗传编辑技术，这一系统相对易于操控。通过受精卵注入Cas9 mRNA和sgRNAs，可以一步生成携带所需突变的小鼠或大鼠。

令人惊叹的是，有研究报告称利用CRISPR-Cas9纠正了人类成体干细胞中与囊性纤维化相关的缺陷。通过尾静脉高压注射传送CRISPR-Cas9系统，研究人员还纠正了小鼠模型肝细胞中的Fah突变，挽救了体重减轻这一表型。此外，有研究称通过将Cas9 mRNA和靶向突变等位基因的sgRNA共同注入到受精卵中纠正了携带Crygc基因或dystrophin基因突变的小鼠，显示了将CRISPR-Cas9应用于基因治疗的可行性。但直接将CRISPR-Cas9系统注入到受精卵无法以100%的效率生成健康后代，并有可能在后代基因组中生成有害修饰，包括脱靶修饰，阻碍了应用CRISPR-Cas9来纠正人类遗传疾病。

在这篇文章中，研究人员报道称他们利用CRISPR-Cas9系统有效地将遗传修饰导入到了SSCs中。利用CRISPR-Cas9系统，他们在SCCs中突变了EGFP转基因或內源的Crygc基因。在移植到不能生育小鼠睾丸的生精小管之后，这些突变SSCs经历了精子发生，生成了圆形精细胞。将这些圆形精细胞注入到成熟卵母细胞中，生成的杂合子后代显示出对应的突变表型。

此外，研究人员证实CRISPR-Cas9诱导的NHEJ或HDR可轻易修复存在于SSCs中的致病Crygc突变 (Crygc−/−)，生成的SSC细胞系携带着纠正的基因，全基因组测序表明没有任何脱靶修饰迹象。利用由这些细胞系生成的圆形精细胞进行受精，以100%的效率生成了具有纠正表型的后代。

这些结果证实借助于CRISPR-Cas9系统可对小鼠SSCs进行有效的基因编辑，由此提供了一个原理证明可通过对SSCs进行基因纠正来治疗遗传性的疾病。